吡咯喹啉醌(PQQ)生物合成途径中PqqF蛋白晶体结构的研究现场报

发布时间:2019-10-07编辑:admin浏览:

  吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone,PQQ)是一种热稳定、水溶性的三环邻醌。它主要作为各种细菌脱氢酶的氧化还原辅因子起作用,属于烟酰胺嘌呤(如NAD)和黄素依懒性辅助因子(如FAD)后的第三类苯醌类辅助因子。沙雷氏菌FS14(Serratiasp.FS14)基因组上合成PQQ的基因簇包括六个基因即pqqA-F。PqqF属于M16家族金属蛋白酶,其作用是将PQQ合成的前体谷氨酸和酪氨酸从底物肽PqqA上切割下来。41997.com但高血糖患者使用后,,为了明确PqqF的催化机制,本研究以Serratia sp.FS14的总DNA为模板,通过PCR的方法扩增出了pqqF基因,并在i C43(DE3)中成功地异源表达了 PqqF蛋白,然后用Ni-NTA亲和层析与凝胶过滤层析的方法分离纯化PqqF蛋白。将纯化到的PqqF蛋白浓缩到10mg/mL,运用座滴气相扩散的方法筛选结晶条件,在4℃,35%tacsimatepH7.0的结晶条件下初筛获得了 PqqF初始晶体,经过正交筛选、additive试剂盒、改变晶体的培养温度、添加不同浓度的还原剂等结晶条件的优化,最终在16℃,结晶母液中添加10 mM的β-ME并结合采用microseeding的方法获得了 PqqF单晶,经X射线 A的完整的衍射数据。由于PqqF与现有已经解析结构的同源蛋白的同源性较低(20%),为了解析其相位,我们采用代谢抑制的方法制备了 PqqF硒代甲硫氨酸衍生蛋白,并获得具有衍射能力的晶体,收集到了 2.8 A的衍射数据,通过Se-SAD的方法成功确定了 PqqF蛋白的相位,解析了 PqqF蛋白的晶体结构。PqqF蛋白晶体的空间群为C2,每个不对称单元中含有2个PqqF蛋白分子。每个PqqF单体分子由4个结构类似的结构域组成,结构域1和结构域2组成了它的N端结构域,结构域3和结构域4组成了它的C端结构域,N端结构域和C端结构域形成了一个闭合的贝壳形的结构。PqqF的锌离子催化中心位于它的N端结构域中,与底物结合相关的保守残基R656和Y663位于它的C端结构域中。PqqF的N端结构域和C端结构域形成了一个9408 A3的催化腔室,PqqF的催化腔室与它的同源蛋白人类胰岛素降解酶(Human insulin-degrading enzyme(IDE))的催化腔室(大约 13000 A3)相比,体积上缩小很多;但PqqF-N端结构域和PqqF-C端结构域是由一个较IDE的连接loop(33个残基)长的37个氨基酸残基的loop连接。因此,PqqF较小的催化腔室和较长的连接loop可能决定着它对底物PqqA的特异性。构建pqqF基因表达质粒时在N端引入的23个氨基酸残基在结晶过程中被PqqF水解掉N端的9个残基(包括6个组氨酸标签中的5个组氨酸残基),剩余的14个残基形成一个coil结构结合到另一个PqqF单体分子的空腔中,这表明PqqF蛋白酶可以切割的肽键并不局限于谷氨酸和酪氨酸旁的4个肽键,其识别和切割位点可能不是非常特异。N端引入的H-13还和锌离子结合基序HxxEH中的H48和H52残基,以及α螺旋5上的E129残基与锌离子形成了配位键,E51起催化作用。H-13与锌离子的Delta G 和 binding energy 都是-16.9 kcal/mol,较其它残基与 PqqF 的 Delta G(-8.2 kcal/mol)和binding energy(-13.6 kcal/mol)低,且它的B-factor值也是14个残基中最低的,这表明N端的H-13与PqqF蛋白分子具有很强的作用力。现场报码开奖直播。N端额外引入的多肽不仅使PqqF蛋白分子处于闭合的构象,且占据了催化中心锌离子与底物结合的位置,从而使PqqF处于一种无活性的构象。

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